表达FMDV表位基因的重组PRRSV的拯救
与复制水平测定
PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目、动脉炎病毒科。根据抗原性差异，PRRSV分为两个基因型：欧洲I型和北美II型，基因组相似性仅约60%。PRRSV基因组长约15kb，具有5’端帽子结构和3’端Poly（A）尾巴，共包括九个开放阅读框（ORF）。ORF1a/1b约占病毒基因组的四分之三，编码病毒的复制酶等非结构蛋白。ORF2-7位于ORF1a/1b的下游，分别编码病毒的结构蛋白GP2-5，膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N。在PRRSV基因组各转录单位上游均有一包含‘UUAACC’样的共有序列，参与调节转录过程，称为转录调控序列（TRS）。
PRRSV主要感染肺泡巨噬细胞（PAM）和成熟的单核细胞，在肺泡巨噬细胞大量复制导致细胞崩溃，进入血液循环和淋巴循环，形成病毒血症。单核巨噬细胞的损伤造成免疫功能紊乱，中和抗体和γ-干扰素产生延迟且水平较低，不能有效地清除血液中的病毒，因此病毒血症持续时间较长。虽然PRRSV感染早期产生的抗体水平较高，但主要是非中和抗体，没有保护效果。PRRSV感染造成免疫抑制，在感染猪体内持续6个月以上，导致继发感染多种疾病。
本研究利用北美型PRRSV Fl12毒株感染性克隆，在ORF1b和ORF2a之间插入单独的阅读框，用于表达外源基因。在该阅读框中引入了特异性酶切位点与TRS6序列，特异性酶切位点用于插入外源基因，位于上游的TRS2调节外源基因的表达，插入的TRS6序列调节下游ORF2的表达。全长克隆通过Poly（A）末端的AclI酶切位点线性化后体外转录得到病毒全长RNA，将病毒RNA电转染BHK-21细胞包装出病毒粒子，然后接种Marc-145细胞传代。通过细胞病变观察，RT-PCR扩增和序列测定，以及荧光定量RT-PCR等方法鉴定重组病毒。
利用PRRSV Fl12毒株感染性克隆表达FMDV多表位基因，一方面，可以测试增加T细胞表位，增强PRRSV免疫原性的可行性；另一方面，可以研究异源基因的表达效率及对PRRSV中和抗体与细胞免疫水平的影响，为PRRSV免疫机理与嵌合病毒载体疫苗研究积累经验。
1、材料与方法
1.1 病毒株、细胞
北美PRRSV Fl12株感染性cDNA克隆由美国林肯大学病毒学中心Fernado A Osorio教授惠赠。BHK-21细胞与Marc-145细胞均为本实验室保存。
1.2 主要试剂和仪器
RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit购自美国QIAGEN公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶、胶回收试剂盒和荧光定量RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；T7启动子体外转录试剂盒、RNA纯化试剂盒购自美国Ambion公司；Super Ⅲ反转录酶购自美国Invitrogen公司；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司；荧光定量RT-PCR仪型号ABI 7500。
1.3 引物和表位设计
根据PRRSV Fl12毒株基因组序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物F11921/R12451扩增插入的外源基因。荧光定量RT-PCR方法检测病毒滴度，采用刘长龙等（2010）建立的方法进行，引物Fl12-SF/Fl12-SR用于制备RNA标准品，引物Fl12-F/Fl12-R和探针Fl12-probe用于荧光定量RT-PCR检测。引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。FMDV B7表位基因的组成参见Cao et al（2013）的报道，B7多表位基因长约750bp。
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表1 引物与探针序列
Table 1 Sequences of primers and probe
1.4 含有外源基因的重组PRRSV感染性cDNA克隆构建
通过Overlap PCR扩增得到Fl12感染性克隆两个BssHⅡ位点之间长约340bp的序列，扩增时在ORF1b和ORF2a连接处引入Nco I、Not I酶切位点和TRS6 序列，将扩增片段插入T载体，阳性质粒命名为T340。利用Nco I与Not I酶切位点将EGFP与B7表位基因插入T340载体，然后再通过BssHⅡ酶切位点插入PRRSV基因组，得到插入外源基因的全长Fl12克隆。
1.5 RNA体外转录
通过Poly（A）末端的AclⅠ酶切位点将重组PRRSV线性化，经苯酚/氯仿抽提纯化后，利用T7启动子体外转录试剂盒合成病毒全长RNA，按转录试剂盒说明书操作。转录产物经苯酚/氯仿抽提纯化、异丙醇沉淀回收用于转染细胞。
1.6病毒拯救
将纯化的全长RNA 按照Ingenio® Electroporation Kits说明书进行电转染BHK-21细胞。转染48h后收集细胞与上清，接种Marc-145细胞，每天观察细胞病变情况。vFl12-EGFP转染BHK-21和感染Marc-145细胞后，于荧光显微镜下观察EGFP表达情况，以此判断是否有重组病毒产生。
1.7 拯救病毒RT-PCR扩增及序列测定
提取第3代拯救病毒总RNA，利用Super Ⅲ反转录为cDNA，然后用引物F11921/R12451扩增插入的B7表位基因。胶回收PCR产物，寄宝生物工程（大连）有限公司测序。
1.8荧光定量RT-PCR检测拯救病毒拷贝数
参考刘长龙等（2010）的方法进行，先制备RNA标准品，利用引物Fl12-SF/Fl12-SR扩增得到探针两侧约375bp目的片段，将其插入T-easy载体；然后以插入目的片段的质粒为模板，利用T7启动子体外转录试剂盒（Ambion）合成RNA标准品，分光光度计测定含量并计算拷贝数。检测第1代拯救病毒的拷贝数。RNA标准品、对照和样品均重复3次，反应体系与程序均参照TaKaRa一步法RT-PCR试剂盒说明书。
2、结果
2.1 拯救病毒细胞病变（CPE）和/或表达EGFP的荧光观察
将第1代拯救病毒接种Marc-145细胞，4-5 d出现典型CPE：细胞聚集，变圆，皱缩甚至脱落。拯救病毒vFl12-EGFP在荧光显微镜下观察到绿色荧光。如图1所示。
图1 拯救病毒CPE和EGFP表达荧光观察
A：正常Marc-145细胞；B： vFl12-B7感染的Marc-145细胞CPE；C： vFl12-EGFP感染的Marc-145细胞CPE；D： vFl12-EGFP感染Marc-145细胞绿色荧光
Fig.1 CPE and fluorescence observation of rescued virus
A: Normal Marc-145 cells; B: CPE of vFl12-B7 infected Marc-145 cells; C: CPE of vFl12-EGFP infected Marc-145 cells; D: Green fluorescence of vFl12-EGFP infected Marc-145 cells
2.2 拯救病毒vFl12-B7 RT-PCR扩增和序列测定
RT-PCR方法检测第3代病毒vFl12-B7的外源序列（引物F11921/R12451）。电泳结果显示，拯救病毒vFl12-B7扩增出约1300bp的电泳条带,而原始病毒扩增出约500bp的电泳条带，说明目的基因插入到了Fl12基因组中；进一步测序分析表明插入的B7表位基因序列正确，能够正确表达出多表位蛋白。测序结果如图2所示。
2.3 拯救病毒荧光定量RT-PCR检测
将制备的RNA标准品10倍梯度稀释（108copies/μL -104copies/μL），绘制标准曲线。收集拯救病毒第1代细胞培养物，提取总RNA，应用荧光定量RT-PCR方法测定病毒拷贝数。标准曲线线性关系较好，相关系数R2为0.99（图3A）。拯救病毒vFl12-EGFP拷贝数为1.4×106copies/μL，vFl12-B7拷贝数为2.2×105copies/μL（图3B）。
图2 第3代重组PRRSV vFl12-B7序列测定与比对分析
上面的序列为原始序列，下面为重组病毒测定的序列
Fig.2 Sequence determination and comparison analysis of the third passage vFl12-B7
Original sequence (above); Sequence of vFl12-B7 (down)
A
B
图3 荧光定量RT-PCR测定第1代重组病毒拷贝数
A：荧光定量RT-PCR标准曲线；B：vFl12-EGFP（绿色）和vFl12-B7(黄色)的扩增曲线
Fig.3 Virus titer of the first passage recombinant virus by fluorescent quantitative RT-PCR
A: Standard curve of fluorescent quantitative RT-PCR; B: Amplification curve of vFl12-EGFP（green）and vFl12-B7(yellow)
3 讨论
猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV感染的主要靶细胞，因此，PRRSV作为病毒载体可以有效的将异源免疫原基因表达递呈于猪呼吸系统，诱导病毒入侵通路的粘膜免疫应答。由于动脉炎病毒基因组结构紧凑，各开放阅读框彼此部分重叠，因此在PRRSV基因组中插入外源基因比较困难。研究表明修饰N蛋白基因3’端序列对病毒复制和生长影响较小，但最多只能插入7个氨基酸。将GFP基因插入nsp2高变区，能够拯救到病毒，但重组病毒传几代后就检测不到绿色荧光。Pei et al（2009）利用PRRSV P129感染性克隆，在ORF1b和ORF2a之间插入独立的转录单位表达GFP，重组病毒能够连续传37代，并稳定表达绿色荧光。说明该位点可以容许插入独立的转录单元，稳定表达外源基因。
本研究在PRRSV ORF1b与ORF2a之间分别插入了EGFP与FMDV多表位基因。重组病毒vFl12-EGFP感染细胞后观察到了EGFP的表达，说明于该位置插入独立的阅读框能够有效表达外源基因。随后采用相同的策略，于该位置插入了FMDV多表位基因，并拯救获得了重组PRRSV。重组病毒vFl12-B7连续传3代，经RT-PCR扩增、序列测定与比对分析，表明FMDV多表位基因正确插入，推测其能够正确表达目的基因。通过荧光定量RT-PCR方法测定了第1代病毒的复制水平，vFl12-EGFP与vFl12-B7的拷贝数分别达到了1.4×106copies/μL 和 2.2×105copies/μL ，表明重组病毒具有较好的复制能力。FMDV多表位基因，包含有通用T细胞表位与FMDV主要中和表位编码序列，如果重组病毒能够正确表达此多表位基因，一方面，可能会诱导产生较好的细胞免疫应答与FMDV中和抗体应答；另一方面，通过增强细胞免疫应答水平，有可能提高针对PRRSV的保护性免疫应答水平，缩短病毒血症持续期。从而为PRRSV疫苗的研究提供新思路，为PRRSV重组病毒载体疫苗积累经验。本研究还需进一步检测外源基因表达的稳定性，以及重组病毒免疫猪后针对PRRSV与FMDV的免疫应答水平，相关工作正在进行之中。
兰州兽医研究所 白伟杰
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